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基于核酸适配体的肉制品中污染物检测技术研究进展

时间:2018-03-05 21:13:38    来源:互联网整理    作者:匿名  浏览次数:
[导语]   摘 要:核酸适配体是经体外筛选技术得到的能够特异性结合靶物质的由十几个或几十个核苷酸组成的寡聚核苷酸片段。适配体分子质量较小、易于体外合成和修饰、化学稳定性好,且不

摘 要:核酸适配体是经体外筛选技术得到的能够特异性结合靶物质的由十几个或几十个核苷酸组成的寡聚核苷酸片段。适配体分子质量较小、易于体外合成和修饰、化学稳定性好,且不依赖于生物体或细胞环境,具有空间结构多样和靶标分子广泛的特点,对包括金属离子、有机小分子、生物分子,甚至细胞和微生物在内的各类靶物质具有特异性识别作用,被誉为“化学抗体”。本文综述了核酸适配体的特点及其筛选方法,列举了核酸适配体在肉制品非法添加物、金属离子、病原微生物以及生物毒素检测中的应用,并对其应用前景进行了展望。

关键词:肉制品;核酸适配体;配体指数富集系统进化技术;制备;分析;应用

Progress in Aptamer-Based Detection of Contaminants in Meat Products

LI Yongbo, ZHANG Wei, ZHANG Cuixia, ZHANG Tao, ZHANG Yalun, ZHOU Wei, ZHANG Yan*

(Hebei Food Inspection and Research Institute, Hebei Key Laboratory of Food Safety, Shijiazhuang 050071, China)

Abstract: Nucleic acid aptamers are oligonucleotide fragments consisting of more than a dozen or dozens of nucleotides that are capable of specifically binding to a target substance obtained by in vitro screening techniques. Aptamers are small molecules and are easily synthesized and modified in vitro. The chemical stability of aptamers is good and does not depend on the biological or cellular environment. Aptamers, also known as “chemical antibodies”, have the characteristics of diverse spatial structure and a wide range of target molecules and specifically recognize metal ions, organic small molecules, biological molecules, and even cells and microorganisms. This paper summarizes the recent literature regarding the binding characteristics of aptamers ligand and the existing methods for screening aptamers, and outlines the applications of aptamers in the detection of illegal additives, metal ions, pathogenic microorganisms and biological toxins in meat products. The prospects for future applications of aptamers are discussed as well.

Key words: meat products; nucleic acid aptamers; systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX); preparation; analysis; application

DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201709013

中圖分类号:TS251.5 文献标志码:A 文章编号:1001-8123(2017)09-0078-05

引文格式:

李永波, 张巍, 张翠侠, 等. 基于核酸适配体的肉制品中污染物检测技术研究进展[J]. 肉类研究, 2017, 31(9): 78-82. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201709013. http://www.rlyj.pub

LI Yongbo, ZHANG Wei, ZHANG Cuixia, et al. Progress in aptamer-based detection of contaminants in meat products[J]. Meat Research, 2017, 31(9): 78-82. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201709013. http://www.rlyj.pub

20世纪以来,生物学飞速发展,成就层出不穷,不断帮助人类认识自我、解密生命。近几十年来,核酸一直作为遗传物质被大众所熟知。随着对脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)和蛋白质相互作用的深入研究,Tuerk等[1]在1990年率先从带有8 个随机序列的RNA文库中筛选到了T4 DNA聚合酶(gp43)的RNA序列,它能特异性结合噬菌体,该技术被命名为配体指数富集系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术。同年,Ellington等[2]成功运用该技术从含有150 bp随机序列的RNA文库中筛选到6 种针对有机小分子染料的RNA寡核苷酸,并命名为“aptamer”,一般将其翻译为“核酸适(识)体”、“核酸适配子(体)”或“适体”。1992年,Ellington等[3]又成功地从含有157 bp的随机序列单链DNA(singlestranded DNA,ssDNA)库中筛选出cibacron blue、reactive green 19和reactive blue 4的aptamer。从此,核酸适配体进入人们的视野,并不断在新的领域得到应用。endprint

1 核酸适配体简介

核酸适配体是经体外筛选技术得到的由十几个或几十个核苷酸组成的寡聚核苷酸片段(即ssDNA或RNA)。尽管ssDNA和RNA不同,但是经核磁共振及X射线晶体衍射等方法发现,SELEX技术筛选得到的2 种适配体都能够折叠形成诸如假结(pseudoknot)、发夹(hairpin)、茎环(stem-loop)和G-四聚体(G-tetramer)等热力学稳定的特殊三维空间结构;基于其单链核酸结构及空间结构的多样性,适配体可以通过结构互补、范德华力、碱基堆积力、静电和氫键等作用与靶分子特异性结合[4-7]。

SELEX技术通过靶分子与大容量化学合成的随机寡核苷酸(主要是ssDNA和RNA)文库作用,形成靶分子-寡核苷酸复合物,通过各种技术将其与游离寡核苷酸分离,再利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体外扩增技术对形成的复合物中的寡核苷酸进行扩增。对可与靶分子特异性结合的寡核苷酸进行反复体外筛选及扩增,达到指数级富集的效果,最终获得可以与靶分子特异性结合的核酸适配体[6]。通过这种方法筛选出的核酸适配体不依赖于生物体或细胞环境,对各类靶物质都具有特异性识别作用,如金属离子、有机小分子、生物分子,甚至细胞和微生物[8-9],被喻为“化学抗体”[10]。

1.1 核酸适配体的优点

相较于抗体和酶,核酸适配体的优势在于[11-15]:

1)筛选方便。核酸适配体通过化学合成的方法得到,不依赖于生物体,避免了动物实验,因此具有筛选出无免疫源性或低免疫源性,甚至有毒靶分子的核酸适配体的潜能;通常制备免疫抗体至少需要3~6 个月,而核酸适配体的筛选周期一般为2~3 个月,有的甚至只需几周。2)易于修饰和标记。核酸适配体的末端易于连接一些活性基团,有利于将其固定在材料基质上,可以在末端修饰一些荧光基团等指示基团,便于检测;而常规抗体的修饰要复杂得多,且成功率不高。3)特异性强、靶分子范围广。核酸适配体对体外筛选靶分子有很高的亲和力,特异性强、目标广泛,包括有机染料、维生素、药物、氨基酸、多肽、蛋白质、抗生素,甚至整个细胞、组织等;理论上任何靶物质都可以通过SELEX技术筛选得到相应的核酸适配体。4)亲和力高。核酸适配体与靶分子形成的复合物的解离常数(dissociation constant,Kd)一般都在mmol/L级别,甚至可达pmol/L水平。5)稳定性好。相较于抗体的容易变性,较高的热稳定性使得核酸适配体备受青睐,甚至变性的适配体也可以再生;且相对于蛋白质抗体,核酸适配体的化学性质更稳定,保存时间更长,制成干粉可室温保存,便于常温运输。6)分子质量小。核酸适配体的分子质量小,对于细胞的渗透性好,结合靶分子时的空间位阻小,具有进行高通量筛选的潜力。

1.2 核酸适配体的缺点

核酸适配体的筛选对仪器和设备有很高的精度要求,制备成本较高;目前研究中的核酸适配体制备方法繁杂,缺乏通用的SELEX筛选方法,且制备周期较长;在体内,核酸适配体极易被胞内的核酸酶降解[16];核酸适配体应用在医学上时,常常由于其较低的分子质量而被肾脏过滤出体外,造成药物在体内的利用率降低[17]。

2 核酸适配体的筛选

采用SELEX技术筛选核酸适配体包括5 个主要步骤:结合、分离、洗脱、扩增和调节[18]。其基本过程[19]如图1所示:首先建立一个随机寡核苷酸文库,库容约1015~1016 个,将靶分子加入到该文库中,在特定的缓冲体系和适宜的温度下孵育,待靶分子与文库中的随机核苷酸充分结合后,再利用过滤、亲和层析、磁珠分离和毛细管电泳等物理方法分离与靶分子结合的核苷酸序列。洗脱和收集同靶分子结合的核苷酸序列,经PCR扩增洗脱和收集得到的序列集成富集的次级文库,再与原靶分子进行下一轮的筛选循环。每个靶分子一般要进行6~20 个连续循环,每轮筛选的同时可以设置亲和力检测实验,当检测到核酸文库对靶分子的亲和力不再增高时即可停止筛选。最后富集的文库要通过克隆和测序来获得最终能够特异识别靶分子的适配体[18]。需要注意的是,大多数适配体与靶分子间的作用力为氢键,RNA文库比DNA文库更具有多样性,但是所得适配体高度倾向被核酸酶结合。因此需要建立动态组合文库,用新的方法来克服适配体化学稳定性的问题[20-21]。

SELEX技术近年来获得了快速发展,开发出了多种新型的筛选方法,大大降低了适配体的筛选周期、提高了筛选效率。例如以提高核酸适配体普适性为目的的筛选方法包括切换筛选(toggling SELEX)、混合筛选(blended SELEX)、表达盒筛选(expression SELEX)和复合靶筛选(complex targets SELEX);以提高核酸适配体选择性为目的的筛选方法包括光交联筛选(photo SELEX)、消减筛选(subtractive SELEX)、反向筛选(counter SELEX)和负筛选(negative SELEX);以缩短筛选周期为目的的筛选方法包括不放大筛选(non-SELEX)、自动化筛选(automated SELEX)和荧光磁珠筛选(fluMag SELEX);将不同结合库相结合以增加目标核酸适配体筛选机率的方法包括加尾筛选(tailored SELEX)和基因筛选(genomic SELEX)[13,22-24]。

图 1 SELEX技术基本流程

Fig. 1 Scheme of SELEX technology

3 核酸适配体在肉制品检测中的应用

由于核酸适配体对靶分子具有高度的特异性和亲和性,目前已将此技术应用于医疗诊断、药物研发、生物影像、色谱分析、生物传感和食品检测等领域,核酸适配体在这些领域正在扮演越来越重要的角色。肉制品与生鲜肉属于快消产品,传统的检测方法耗时较长,不利于监管,因此建立快速、准确、有效的检测方法,甚至是现场检测方法有非常大的现实需求。本文总结了近年来核酸适配体技术在食品安全领域的应用,尤其是在肉品检测中的应用。endprint

3.1 非法添加物检测

畜牧养殖中的非法添加物一直是影响肉制品质量安全的重要因素,瘦肉精位列我国动物药品禁用目录之首,主要包括盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺3 种。巩文慧[25]采用文库固定化SELEX技术同时筛选制备盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺3 种瘦肉精的适配体,经过16 轮正筛和7 次反筛及验证后,获得1 条可以同时识别盐酸克伦特罗和沙丁胺醇的Apt-3序列,结合Kd分别为(38.45±7.01)、(47.00±6.42) nmol/L,表明此序列对2 种靶分子均有较高的结合能力;同时获得了能分别特异性识别盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的适配子,且Kd值都很高;实验进一步构建了荧光分析法,得到各个适配体的检出限,并用于实际猪肉样品的检测,回收率为84.50%~110.50%,表明该实验思路有进一步研究的空间。王勇[26]建立了采用毛细管电泳法和荧光实时定量PCR技术对筛选过程中的PCR结果进行表征的方法,利用毛细管电泳技术进行了4 轮SELEX筛选,得到13 条ssDNA,大大缩短了筛选次数。

抗生素作为兽药过量使用会造成食源性动物食品中抗生素的残留,损害人类健康,从而成为食品安全领域的重要议题。游元丁[27]构建了一种基于石墨烯(Gr)及适配体的卡那霉素传感检测方法,对卡那霉素进行电化学检测的结果表明,在优化条件下用差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)检测卡那霉素,在1×10-6~1×10-5 mol/L范围内呈现良好的线性关系,检出限为5×10-7 mol/L。高慧菊等[28]基于核酸适配体的高选择性和氧化钯纳米颗粒标记聚合酶螯合物的双重信号放大效应,建立了快速检测鱼肉和鹅肉中痕量氯霉素的方法,在最佳实验条件下,该方法具有较高的检测灵敏度,且在0.02~150.00 ng/mL范围内具有良好的线性关系,检测下限为0.01 ng/mL。

动物激素常被用作生长促进剂,被非法用于畜牧养殖业,引发了诸如儿童性早熟等问题。白文荟[29]以适配体技术为基础,结合纳米金,并基于片段化适配体荧光猝灭机理建立了特异性良好的19-去甲基睾酮快速检测方法,优化后方法的检测限为5 μmol/L,并在尿液样品中成功应用,3 个加标浓度下所得加标回收率为57.94%~118.76%,平均相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)小于7%,表明方法具有较好的重复性和稳定性。

3.2 重金属检测

废气、废水排放以及污水灌溉、养殖等因素造成了重金属在肉制品安全领域越来越受重视。相较于原子吸收昂贵、庞大的仪器设备以及检验成本,研究人员在核酸适配体领域已经研发出了多种现场快速检测重金属的定性和半定量方法。

王法泽[30]根据显色比色法的原理建立了检测As3+的方法,其基本原理是氯化血红素对3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)的催化作用;当溶液中不含As3+时,核酸适配体通过堆积作用使得氯化血红素的催化活性受到抑制,对底物TMB的催化能力减弱,溶液呈现蓝色;当溶液中含有As3+时,As3+可以与适配体ssDNA特异性结合形成复合结构,这种复合结构会阻碍堆积作用,因此氯化血红素可以催化TMB,溶液由蓝色变为黄色。Chung等[31]建立了一种基于微流体传感器,利用表面增强拉曼散射光谱分析样品中微量Hg2+的方法,方法准确、快速,且灵敏度高。

3.3 病原微生物检测

食源性病原微生物是世界各国食品安全面临的普遍问题,其中又以沙门氏菌的危害最为普遍。根据世界卫生组织的相关报告[32],1985年以来,全世界已确诊的由沙门氏菌引起的患病人数显著增加,一些欧洲国家的增幅甚至已达5 倍以上;在我国,由沙门氏菌引起的食品安全事件数量屡居首位。吴斌等[32]的研究表明,在我国的细菌性食物中毒事件中,70%~80%是由沙门氏菌引起的,而在由沙门氏菌引起中毒的食品中,肉类等动物性产品占90%以上。宁毅[33]在对碳纳米管性质研究的基础上,结合分子探针构建了基于生物功能化的碳纳米管生物传感器对沙门氏菌进行检测,所构建的传感器具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优势;对于适配体控制细菌菌膜形成的研究不仅拓展了适配体的应用范围,而且在减少抗生素的使用、降低耐药性菌株的产生等方面也具有重要意义。Ko等[34]将鼠伤寒沙门氏菌的G蛋白标记上荧光猝灭分子,用标记了荧光分子的抗体去捕捉猪肉样品中的菌体,根据荧光变化定量检测猪肉中的鼠伤寒沙门氏菌,检测下限达105 CFU/g。

徐李舟[35]提出了对4 种食源性致病菌同时分离和检测的荧光适配体传感器法的原理,并应用到牛肉样本中同时检测大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌,是文献报道中可同时检测细菌种类最多的一种方法。付梦玉等[36]利用肠毒素大肠杆菌K88(E.coli K88)特异的适配体结合纳米金和银增强技术建立了一种约2 h检测E.coli K88的可視化技术,检测灵敏度达10 CFU/g,并通过人工模拟E.coli K88污染猪肉等食品原料对方法进行了验证。Bruno等[37]针对空肠弯曲菌表面蛋白的MgCl2开发适配体,选择了2 种亲和性最高的适配体用于磁珠(magnetic beads,MB)和基于红色量子点(quantum dots,QD)的夹心测定方案,并证实该荧光法可用于牛肉中空肠弯曲菌的检测。Ohk等[38]开发了用于特异性检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的抗体和适配体功能化的光纤生物传感器,该方法成功检测到了牛肉、鸡肉和火鸡肉中初始接种量为100 CFU/25 g的单核细胞增生李斯特氏菌。

3.4 生物毒素检测

赭曲霉素A(ochratoxin A,OTA)是很多食品中普遍存在的毒枝菌素,在肉类产品中经常检出。研究人员已经基于OTA适配体开发出了一系列快速原位检测方法[39]。Yang等[40]以未修饰的纳米金(gold nanoparticles,AuNPs)作为比色指示剂,在经OTA适配体修饰的AuNPs稳定溶液中加入OTA,当适配体特异性结合OTA时会改变构象,变为G-四分体结构,从AuNPs表面脱离,溶液中继续加入NaCl后,AuNPs会因静电斥力而聚集,溶液颜色由红变蓝,经验证该方法检出限可达20 nmol/L,灵敏度较高。Wang Libing等[41]研发了基于适配体修饰的AuNPs的比色层析侧向流动装置来检测OTA,其原理是靶标物质OTA和与适配体碱基互补的DNA探针共同存在于溶液中时会竞争结合吸附在AuNPs粒子表面的适配体,AuNPs粒子在溶液中由于毛细作用而在试纸上进行迁移,当检测互补DNA探针结合AuNPs粒子表面的适配体时会发生颜色变化,根据颜色深浅可判断样品中OTA的浓度。endprint

玉米赤霉烯酮(zearalnenoe,ZEN)是镰刀菌属真菌在生长过程中所产生的次生代谢产物,可以直接污染多种谷物、饲料以及肉、蛋、乳等诸多动物源性食品,是一种非常普遍的污染物。邹绮[42]以ZEN毒素的单克隆抗体为靶标,成功筛选得到具有抗原内影像关系的DNA适配子,在建立检测方法时用它替代毒素本身,研发出低毒、环保的检测试剂盒,确保毒素检测过程中实验人员的安全,同时能够保护环境;实验采用SELEX技术,以ZEN单克隆抗体为靶分子,经过15 轮筛选,测得ssDNA富集文库与ZEN单克隆抗体的亲和力得到有效提升,接着又以46号克隆适配子建立酶联寡核苷酸实验检测方法,批内(7.6%)和批間差异(9.3%)均小于10%,表明该方法可靠性较好。

4 结 语

总体上讲,将核酸适配体技术应用到肉制品乃至食品中危害因子检测的研究尚处于起步阶段,将其应用到实际检测领域仍面临很多问题:第一,食品种类繁多,成分复杂,造成了很强的背景干扰,需要利用固相萃取技术对肉制品样品进行预处理;第二,目前已经筛选得到的适配体数量有限,针对肉制品检测的适配体更为稀少,大范围筛选更多肉制品危害因子的适配体成为当务之急;第三,当前适配体筛选方法种类繁多,但大多周期较长、效率偏低、通量较小,开发高通量、低成本的筛选方法成为亟待解决的问题。

核酸适配体强大的功能及其快速发展为肉类中非法添加物、病原微生物、生物毒素和重金属等危害因子的痕量快速检测及分析提供了途径,近年来材料技术的飞速发展为适配体提供了更加广阔的检测应用前景。尽管核酸适配体检测技术与传统的检测技术相比尚不成熟,但是我们有理由相信经过不断发展和完善,适配体技术必将在肉制品快速检测领域占有一席之地。

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